啮齿类动物粪菌移植实验的实际考虑因素

编译|杰克鲍尔

你有一个科学问题假设，有无菌受体小鼠，并且还有一份你想要在这些小鼠身上研究的感兴趣的肠道微生物群，你是否已经真的准备好进行粪菌移植实验了？以下是在啮齿动物中进行粪菌移植实验时最常遇到的实际问题。

尽管大量的研究活动集中在了解动物模型中宿主-微生物组的相互作用上，但体内研究科学家面临的许多实际应用问题尚未在文献中得到最终解决。尽管这些考虑因素很简单，但它们经常被专门研究微生物组的体内研究科学家引用为关注点。

在这里，我们将讨论六个你在计划实验时应该考虑的经常遇到的实际问题。做出正确的决定可能对你的实验结果非常重要，并可能提高研究和实验室之间的可重复性。仔细考虑每一个步骤，根据你的实验的具体需要，将帮助你最大限度地利用你的动物和经费，并作出最好的研究。粪菌移植，也称为粪便微生物移植(FMT)或肠道微生物移植(GMT) (Jayasinghe et al. 2016)，是将收集的肠道微生物群从一个个体转移到另一个个体的过程。在人类中， FMT 的目的是通过将健康人的微生物群转移到患病人的肠道来治愈特定的疾病——最常见的是复发性感染艰难梭菌、溃疡性结肠炎或克罗恩病(Choi & Cho 2016; Gupta et al. 2016)。在动物研究中，粪菌移植是微生物组研究中的一个重要工具，可以指在动物之间，通常是在小鼠之间，或在不同物种之间，最常见的是从人类到小鼠之间转移微生物。

移植物的收集

粪菌移植的字面意思是转移来自供体的粪便，这个术语通常用来描述来自供体肠道不同部位的肠内容物的转移。在人体中，粪便是最常用的(因为容易获得) ，但这一过程也可能涉及内窥镜取样直肠近端的内容物，例如与病人的肠组织活检同时取样。使用啮齿动物供体有利于侵入性甚至终端取样，因此啮齿动物粪菌移植可能涉及粪便、盲肠、结肠或回肠内容物，甚至混合物的转移。在特定的研究中，可能会有争论不牺牲供体动物，这将留下粪便或手术收集作为唯一的选择。

收集位置重要吗？

一般来说，粪便材料被认为是胃肠道微生物群的良好代表(Lepage et al. 2005)，尽管肠道中不同局部生态位之间的组成和多样性肯定存在差异。与空肠和回肠相比，盲肠、结肠和粪便中的细菌多样性最高，并且这些位点之间的组成差异得到了很好的描述（Gu et al. 2013; Hill & Artis 2010; Lepage et al. 2005）。大多数与宿主的免疫相互作用发生在回肠，因为这是称为派尔氏斑的淋巴结构的主要部位，通常显示出高丰度免疫细胞。然而，与盲肠和结肠相比，小鼠回肠中的细菌和粪便数量很少，这就是为什么通常首选盲肠和结肠这些部位进行采样的原因。

另一个考虑因素是肠腔的细菌群落与与粘液层密切相关的群落不同（Hill & Artis 2010；Lepage，2005）。出于某些目的，确保在移植中代表粘液居住的细菌可能特别重要。由于它们接近宿主，它们可能具有显著的免疫调节特性，因此肠道粘膜刮伤可以被认为是管腔移植的附加物。为了达到通过粪菌移植转移疾病表型的目的，从发生特定病理事件的部位转移肠内容物可能是最佳的，例如结肠炎时从结肠转移肠内容物。然而，很少有研究探索表型转移是否与不同的供体移植收集位点不同。

暴露于氧气

哺乳动物肠道中的大多数细菌种类都是严格的厌氧菌（Evaldson，1982），这意味着暴露在氧气中很容易杀死它们。通常会付出巨大的努力来在密闭容器中收集人类供体材料，并在低氧/无氧条件下（例如在厌氧室）中对移植物进行均质化、过滤和其他机械操作。通常，人类供体样本将提供大量材料，允许从粪便块的核心取样，并避免在样本排空期间暴露于氧气的区域。与人类对应物相比，动物安乐死后可以在厌氧室内对来自动物的供体移植物进行采样。对于所有移植类型，建议使用脱氧溶液稀释和均质化移植物。通过在移植发生前立即从冰箱或厌氧室中取出移植物，可以确保最短的氧气暴露时间。如果无法进入厌氧室，则可以在通风橱或装有 CO₂ 的开放式容器中的生物安全柜内对移植物进行半厌氧处理（例如啮齿动物安乐死盒）。

然而，对共生细菌孢子的形成还缺乏详细的了解。众所周知，需氧条件和 -80 ℃ 的冷冻会改变体外培养的细菌群落(Lau et al，2016) ，但是这里提到的厌氧做法是否会影响体内受体中细菌的存活率，以及到什么程度，还没有系统地研究过。

有人提出，比以前知道的更多的细菌物种能够产生孢子(Browne，2016)。这可能部分解释了为什么通过共同居住的微生物群导致的表型转移已经成功(Ridaura，2013; Celaj，2014)。由于啮齿类动物有食粪行为，因此，在共同居住的啮齿类动物中，微生物群传播的主要途径预计是通过口服粪便颗粒。例如，小鼠粪便颗粒的小尺寸可能使氧气到达颗粒的核心，理论上使氧敏感肠道微生物群的生存处于危险之中。因此，可以假设，直肠氧张力的增加促进了比以前知道的更多物种的孢子形成，从而确保了消化颗粒的个体的成功自然定殖。

啮齿动物粪菌移植实验中常见的给药途径是通过口服灌胃。这种做法要求将粪便物质均质化，稀释到适当的粘度，并从移植物中清除大的碎片和颗粒，以便于通过狭窄的灌胃针进行给药。为此目的可以使用各种方法，如使用搅拌机、均质机、人工破坏粪便颗粒，或通过钢丝网过滤器、咖啡过滤器等过滤。在所有情况下，必须考虑无菌和厌氧条件。

移植物的贮存

无论你是使用新鲜的还是冷冻的标本进行移植，稀释液对于大多数物种来说都应该是非抑菌的。蛋白胨水，生理盐水，磷酸盐缓冲生理盐水(PBS) ，甚至牛奶经常被认为是适合细菌悬浮液的等渗介质。迄今为止还没有证据表明稀释培养基是否会对临床 FMT 程序的结果产生差异。在稀释介质中添加一种低温保护剂，如甘油或二甲基亚砜(DMSO)，是否有利于移植物在受体体内的定植，或者移植物的单纯快 速冷冻是否足够，目前尚不清楚。低温保护剂的添加通常是为了提高细菌、病毒和真菌的存活率，但这些低温保护剂对古细菌、原生生物或微生物有什么作用还不清楚。如果分析含有冷冻保护剂的粪菌移植物以推断微生物群组成，则 DNA 提取或 PCR 等下游程序可能受到冷冻保护剂存在的影响，进而可能改变推断的组成。因此，建议包括未经处理的供体样品用于下游分析。新鲜标本和冷冻标本已被证明对复发性艰难梭菌感染的临床治疗同样有效(Hamilton，2012; Lee，2016)。然而，由于稀释培养基和储存，定植模式中可能存在更微妙的影响，这在动物研究中将是相关的。通过对 6 个选定的细菌特异性16s rRNA 基因进行定量 PCR，Bahl 等人发现，冷冻人体粪便样品会影响其微生物群的组成(Bahl，2012) ，但在受体动物中定植后是否会反映这一点仍有待研究。在决定处理和储存移植物的最佳方法时，必须考虑粪菌移植实验的目标。为了显示不同微生物群之间的粗略差异，稀释培养基的选择以及使用新鲜或冷冻移植物(有或没有冷冻保护剂)的重要性可能不如那些即使是微妙的表型或组成变化也令人感兴趣的实验重要。

移植受体的给药

描述了用于治疗粪菌移植的人类患者的各种给药途径。据报道，结肠镜检查或保留灌肠占 75% ，鼻胃管或鼻十二指肠管或鼻食管胃十二指肠镜检查占 25% (Aroniadis& Brandt，2013)。就改善疾病或定植效率的能力而言，没有确凿的证据表明哪种途径是可取的(Choi & Cho，2016)。除了美观之外，与“自上而下”路线相关的考虑因素包括小肠过度生长的风险、误吸的风险、心室中酸敏感细菌的死亡以及结肠缺乏完全定植。“自下而上”方法的考虑主要涉及移植排斥和穿透已经患病和发炎的肠道的风险。

在啮齿类动物中，口胃给药途径或口服灌胃得到了最广泛的使用，主要是由于技术的简便性、给药量的完全控制以及因为不需要对受体进行麻醉。直肠给药有时与口服灌胃联合使用以优化定植，但这种技术可能会给动物带来更大的压力，并且可能需要麻醉。另一方面，口胃给药途径可能选定酸性胃环境不耐受的物种死亡而嗜酸细菌会存活，这可以解释为什么观察到小鼠粪便移植后乳酸杆菌物种大量繁殖（Zeng et al. 2013）。

一轮定殖足够吗？对于复杂微生物群的移植，这个问题尚未得到系统的研究。在人类患者中，通常使用几轮移植来获得最佳的临床结果，特别是在使用保留灌肠时。然而，人类并不像大多数啮齿动物受体那样是无菌的或实际上是无菌的，因此定殖的条件不是直接可比的。通常认为用复杂的微生物群进行一轮以上的定殖可以提高动物的定殖效率。对于用 Altered Schaedler Flora (ASF) 定植大鼠或小鼠，在给药几天后即可达到良好的定植效果。这允许耐氧物种首先定殖并降低肠道中的氧张力，支持随后由严格的厌氧菌定殖。虽然复杂的微生物群通常通过口服灌胃转移，但是通过将 ASF 供体动物的粪便颗粒悬浮在水中，可以通过饮用水成功转移 ASF。这种方法要求受体动物在一夜之间被剥夺水分，确保它们尽可能快地从定殖地的水中饮水，以尽量减少严格的厌氧菌的死亡。因此，在夜行动物活跃阶段被剥夺水分所造成的生理和心理影响，必须与福利影响和其他程序(例如反复口服管饲法)的可行性相平衡。一氧化碳容器是一个温和和相对容易的方式转移个体之间的微生物群，但要求你拥有的动物窝藏感兴趣的微生物群，不能用于第一代物种之间的转移。通过共同住所进行的微生物群转移往往是不完整的((Ericsson & Franklin 2015) ，但该方法在转移成功时仍有助于证明依赖微生物群的表型，而缺乏表型转移则不排除微生物群的作用。应该给予关注，以尽可能少的压力给予接受者。已知应激会引起微生物群的变化(Bangsgaard Bendtsen，2012; Watanabe，2016) ，因此也可能影响粪菌移植后的定殖效率。一个常见的方法是从隔离器中移除无菌的怀孕母鼠，并在它们出生前几天进行定殖，从而产生具有感兴趣的微生物群的后代。对于一些小鼠品系，特别是一些转基因品系，在接近出生时进行口服喂养和重新归巢的处理压力可能导致幼崽自相残杀。因此，一个考虑因素可能是在妊娠早期，甚至在妊娠之前，将隔离器中的母鼠移除。最近研究表明，母体微生物群在妊娠期形成幼崽的免疫系统(Gomez de Agüero，2016) ，因此母鼠定殖的时机可能很重要。

与任何给药程序一样，遵守给药途径、物种和年龄的最大给药量指南是至关重要的。特别是对于3 周龄以下的小鼠幼崽， 如果体积太大，则吸入或溺水的风险增加。作为幼崽的替代品，粪便悬浮液可以通过让幼崽喝吸管中的水滴来实施。其他给药途径可能包括在泌乳母鼠的腹部施用粪便悬浮液，或者甚至通过将粪便悬浮液蒸发到隔离器中。这种方法可能与更传统的途径相结合，以增强定植，但应该解决暴露于氧气的影响。受者的年龄是影响定植和随后的免疫形成的重要因素。在三周龄的无菌小鼠中定殖导致了微生物群与供体的非常相似，但也导致了在生命后期的促炎免疫表型——这两个特征在一周龄的幼鼠中定殖时没有实现(Hansen，2012)。另一方面，经过抗生素处理的小鼠在 3 或 8 周龄时定殖，也同样成功(Ellekilde，2014)。接受者的微生物状态，即无菌或抗生素耗尽或未经处理的微生物群，也影响定植(Lundberg，2016)。由于缺乏内源性微生物群，无菌小鼠被认为是微生物组研究的最先进工具。由于无菌小鼠在许多方面都缺乏免疫学反应，因此与 ASF 或复杂微生物群的小鼠相比，它们对病原体感染更敏感。目前还没有关于啮齿动物粪菌移植导致死亡的公开报道，但是这个过程确实带来了一些风险。接受 FMT 治疗的人类患者在手术后的第一天会出现短暂的发热、便秘、腹泻、恶心、呕吐和腹胀(Choi& Cho，2016)。因此，啮齿动物可能会经历一些相同的症状。此外，与人类对小鼠移植的情况一样，受体外来的微生物可以引起炎症反应增加。无论采取哪种给药方法，都应当强调，需要在移植后至少 24 至 48 小时内加强对受体动物的监测。

从接受者身上取样

粪便取样是从接受者那里收集材料进行微生物组分析的首选方法。这是由于易于访问和纵向分析的机会。粪便样本可以取自单个小鼠，也可以通过笼子、群体、废弃物或设施汇集。新鲜的样品可以通过“揉捏”动物来获得。在大多数情况下，这种做法很容易引起自发排便，颗粒可能被捕获在无菌试管中。轻轻摩擦腹部可能会进一步促进排便。然而，通过擦洗获得新鲜的排便实际上是基于应力反应，并可能是特别紧张时，隔离做戴着厚橡胶手套。一个更温和的方法是把动物放在干净的笼子里，等待排便，这通常会在 10 到 60 分钟内发生。这种方法适用于非常年轻的小鼠，其中每个颗粒的粪便量非常小，因此有必要收集几个颗粒用于下游分析。在不牺牲动物的情况下从盲肠取样的外科手术显示(Pang et al,2012) ，经过一周的术后抗生素和两周的恢复，粪便微生物群与非手术小鼠没有什么不同。同一项研究得出的结论是，同一只小鼠的粪便和盲肠微生物群不能相互代表，强调在某些情况下可采用粪便颗粒取样的替代方法。例如，你的研究设计可能包括增加群体规模，允许在不同时间点牺牲动物，以便对非粪便微物群进行纵向分析，尽管这不包括随着时间的推移跟踪同一动物。喂食模式和昼夜节律已被证明会引起小鼠微生物组的波动(thiss，2015;Voigt，2014; Liang，2015;Zarrinpar，2014; thiss，2014) ，特别是在雌性小鼠中(Liang，2015)。因此，建议在一天的同一时间收集粪便样品。

安全考虑

只要遵守共同的实验室安全指引，处理啮齿动物的粪便或肠道内容物通常不会对有关人员的健康构成风险。世界上大多数啮齿动物群体都具有无特定病原体动物健康状况，这就排除了对动物或研究有害的传染性病原体，以及能够引起人类疾病的人畜共患病。然而，随着描述肠道微生物群形成免疫系统的研究的展开，人们越来越认识到，实验室啮齿动物在免疫系统的某些方面是稚嫩的(Reese，2016; Beura，2016) ，可能是由于微生物多样性的丧失和早期的感染。这促使人们对使用野生捕获的或宠物店的小鼠进行研究产生了兴趣，因此增加了实验室中携带病原体的动物的暴露。人员(以及设施中的 SPF啮齿类动物)应该适当保护，以避免与处理这些潜在传染性啮齿类动物有关的风险。在动物研究中使用人类粪菌移植也需要考虑安全问题。在人对人的粪菌移植中，捐献者要接受彻底的访谈和筛查，以确定是否有血液和粪便传播的感染(Choi & Cho，2016)。同样的筛查原则也适用于人体对动物的移植，以保护研究人员和动物护理人员，尽管筛查计划不能完全消除隐性感染的风险。将看似健康的微生物群移植到小鼠中可能会使潜在的人类病原体繁殖，增加其传染潜力。通常，实验的目的是研究有限规模的人类患者队列中的微生物群，因此排除所有未通过广泛筛查和访谈程序的捐献者可能是不可行的。在进行人体粪菌移植工作时，应始终采取适当的安全措施，包括对工作区进行净化，使用个人防护设备，以及将接受移植的动物安置在诸如隔离器或单独通风的笼子等受保护系统中。

结论

在计划你的粪菌移植实验时，有许多小而实际的步骤需要考虑。在这里，我们讨论了与移植收集、储存、处理、安全和给药有关的步骤。其中许多是基于当前微生物组研究中的同行评议文献，而其他则是从经典微生物学中汲取知识。目前还缺乏对粪菌移植方法的优缺点的现代系统研究，使得个别研究小组只能选择适合其具体项目和资产的方法。虽然这种方法确实值得称赞，也很重要，但是在粪菌移植后哪种方法产生最佳定殖是不确定的。对这里描述的概念进行更详细的研究可能会导致更成功、更可重复的实验，并最终提出粪菌移植的“黄金标准”的建议。强烈鼓励发表啮齿动物粪菌移植实验最佳做法的方法学研究论文。

REFERENCE

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